Дякуємо за відвідування www.chinacdoe.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Системи Lab-on-a-Cip із можливостями на місці пропонують потенціал для швидкої та точної діагностики та корисні в умовах обмежених ресурсів, де немає біомедичного обладнання та навчених фахівців.Однак створення системи тестування на місці надання медичної допомоги, яка одночасно має всі необхідні функції для багатофункціонального дозування, випуску за вимогою, надійної роботи та тривалого зберігання реагентів, залишається серйозною проблемою.Тут ми описуємо технологію мікроперемикача ходу з важелем, яка може маніпулювати рідинами в будь-якому напрямку, забезпечуючи точну та пропорційну реакцію на прикладений тиск повітря та залишаючись стабільною проти раптових рухів і вібрацій.Базуючись на цій технології, ми також описуємо розробку системи полімеразної ланцюгової реакції, яка об’єднує функції введення реагенту, змішування та реакцію в одному процесі, що забезпечує продуктивність «зразок-у-відповідь-вихід» для всіх клінічних назальних зразків від 18 пацієнтів з Грип та 18 індивідуальних контролів, добре узгоджуються інтенсивність флуоресценції зі стандартною полімеразною ланцюговою реакцією (коефіцієнти Пірсона > 0,9).Базуючись на цій технології, ми також описуємо розробку системи полімеразної ланцюгової реакції, яка об’єднує функції введення реагенту, змішування та реакції в одному процесі, що забезпечує ефективність «зразок-у-відповідь-вихід» для всіх клінічних назальних зразків від 18 пацієнтів з грипом та 18 індивідуальними контролями, добре узгоджуючи інтенсивність флуоресценції зі стандартною полімеразною ланцюговою реакцією (коефіцієнти Пірсона > 0,9).Основуючись на цій технології, ми також описуємо розробку системи полімеразної цепної реакції, яка об’єднує функції введення реагентів, змішування та реакції в одному процесі, що забезпечує виконання «образця-в-відповіді-виходу» для всіх клінічних зразків із носа 18 пацієнтів з Гриппом. і 18 окремих контролів, у хорошій відповідності інтенсивності флуоресценції зі стандартною полімеразною цепною реакцією (коефіцієнти Пірсона> 0,9).Базуючись на цій технології, ми також описуємо розробку системи полімеразної ланцюгової реакції, яка поєднує в собі функції введення, змішування та реакції в одному процесі, уможливлюючи вибірку у відповіді для всіх клінічних назальних зразків від 18 хворих на грип.і 18 індивідуальних контролів, що добре узгоджується зі стандартною інтенсивністю флуоресценції полімеразної ланцюгової реакції (коефіцієнти Пірсона > 0,9).Базуючись на цій технології, ми також описуємо розробку системи полімеразної ланцюгової реакції, яка об’єднує введення реагенту, змішування та реакційні функції для аналізу всіх клінічних назальних зразків із 18 назальних зразків пацієнтів. Грип та 18 індивідуальних контролів, інтенсивність флуоресценції відповідає добре зі стандартною полімеразною ланцюговою реакцією (коефіцієнт Пірсона > 0,9).Запропонована платформа гарантує надійну автоматизацію біомедичного аналізу і, таким чином, може прискорити комерціалізацію низки тестових пристроїв для надання медичної допомоги.
Нові захворювання людини, такі як пандемія COVID-19 2020 року, яка забрала життя мільйонів людей, становлять серйозну загрозу глобальному здоров’ю та людській цивілізації1.Раннє, швидке та точне виявлення захворювань має вирішальне значення для контролю над поширенням вірусу та покращення результатів лікування.Основна діагностична екосистема, що базується на централізованих лабораторіях, де тестові зразки надсилаються до лікарень або діагностичних клінік і керуються професіоналами, наразі обмежує доступ для майже 5,8 мільярдів людей у всьому світі, особливо тих, хто живе в умовах обмежених ресурсів.де бракує дорогого медичного біообладнання та кваліфікованих спеціалістів.клініцисти 2. Таким чином, існує нагальна потреба в розробці недорогої та зручної системи лабораторії на мікросхемі з можливістю тестування на місці надання медичної допомоги (POCT), яка може надати клініцистам своєчасну діагностичну інформацію для прийняття обґрунтованих рішень щодо діагнозу .і лікування 3.
Рекомендації Всесвітньої організації охорони здоров’я (ВООЗ) стверджують, що ідеальний POCT має бути доступним, зручним у використанні (легким у використанні з мінімальною підготовкою), точним (уникати хибнонегативних або хибнопозитивних результатів), швидким і надійним (забезпечувати хороші властивості повторюваності) та готовий до доставки (здатний до тривалого зберігання та легкодоступний для кінцевих користувачів)4.Щоб відповідати цим вимогам, системи POCT повинні забезпечувати наступні функції: універсальне дозування для зменшення ручного втручання, випуск реагенту за вимогою для транспортування масштабу для отримання точних результатів тестування та надійну роботу, щоб витримувати вібрацію навколишнього середовища.В даний час найбільш широко використовуваним пристроєм POCT є стрічка бічного потоку5,6, що складається з кількох шарів пористих нітроцелюлозних мембран, які штовхають дуже невелику кількість зразка вперед, реагуючи з попередньо іммобілізованими реагентами за допомогою капілярної сили.Незважаючи на те, що вони мають низьку вартість, простоту використання та швидкі результати, пристрої POCT на основі проточних смужок можна використовувати лише для біологічних тестів (наприклад, тестів на глюкозу7,8 і тестів на вагітність9,10) без потреби в багатоетапному аналізі.реакції (наприклад, завантаження кількох реагентів, змішування, мультиплексування).Крім того, рушійні сили, які контролюють рух рідини (тобто капілярні сили), не забезпечують належної узгодженості, особливо між партіями, що призводить до поганої відтворюваності11 і робить бічні смуги потоку в першу чергу корисними для якісного виявлення12,13.
Розширені виробничі можливості на мікро- та нанорозмірах створили можливості для розробки мікрофлюїдних пристроїв POCT для кількісних вимірювань14,15,16,17.Шляхом регулювання властивостей поверхні розділу 18, 19 і геометрії каналів 20, 21, 22 можна контролювати капілярну силу і швидкість потоку цих пристроїв.Однак їхня надійність, особливо для сильно зволожених рідин, залишається неприйнятною через неточності виготовлення, дефекти матеріалу та чутливість до вібрацій навколишнього середовища.Крім того, оскільки капілярний потік створюється на межі рідина-газ, додатковий потік не може бути введений, особливо після заповнення мікрофлюїдного каналу рідиною.Тому для більш складного виявлення необхідно виконати кілька етапів введення зразка24,25.
Серед мікрофлюїдних пристроїв відцентрові мікрофлюїдні пристрої наразі є одним із найкращих рішень для POCT26,27.Перевага механізму приводу полягає в тому, що рушійною силою можна керувати шляхом регулювання швидкості обертання.Однак недоліком є те, що відцентрова сила завжди спрямована до зовнішнього краю пристрою, що ускладнює реалізацію багатоетапних реакцій, необхідних для більш складних аналізів.Незважаючи на те, що додаткові рушійні сили (наприклад, капіляри 28, 29 та багато інших 30, 31, 32, 33, 34, 35) на додаток до відцентрової сили вводяться для багатофункціонального дозування, непередбачене переміщення рідини все ще може статися, оскільки ці додаткові сили, як правило, порядку величина нижча за відцентрову силу, що робить їх ефективними лише в малих робочих діапазонах або недоступними за потреби з випуском рідини.Включення пневматичних маніпуляцій у відцентрові мікрофлюїдики, такі як відцентрові кінетичні методи 36, 37, 38, термопневматичні методи 39 та активні пневматичні методи 40, виявилося привабливою альтернативою.За допомогою контрфугодинамічного підходу додаткова порожнина та з’єднувальні мікроканали інтегровані в пристрій як для зовнішньої, так і для внутрішньої дії, хоча його ефективність накачування (в діапазоні від 75% до 90%) сильно залежить від кількості циклів накачування та в’язкості. рідини.У термопневматичному методі латексна мембрана та камера для передачі рідини спеціально розроблені для герметизації або повторного відкриття вхідного отвору, коли захоплений обсяг повітря нагрівається або охолоджується.Однак налаштування нагрівання/охолодження створює проблеми з повільною реакцією та обмежує його використання в термочутливих аналізах (наприклад, ампліфікація полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)).Завдяки активному пневматичному підходу розблокування за вимогою та рух всередину досягаються за рахунок одночасного застосування надлишкового тиску та точно узгоджених швидкостей обертання високошвидкісними двигунами.Існують інші успішні підходи з використанням лише пневматичних приводів (позитивний тиск 41, 42 або негативний тиск 43) і конструкції нормально закритих клапанів.Послідовно застосовуючи тиск у пневматичній камері, рідина перистальтично перекачується вперед, а нормально закритий клапан запобігає зворотному потоку рідини через перистальтику, таким чином реалізуючи складні рідинні операції.Однак наразі існує лише обмежена кількість мікрофлюїдних технологій, які можуть виконувати складні операції з рідиною в одному пристрої POCT, включаючи багатофункціональне дозування, випуск за вимогою, надійну роботу, тривале зберігання, обробку рідин з високою в’язкістю, і економічно ефективне виробництво.Все одночасно.Відсутність багатоетапної функціональної операції також може бути однією з причин того, чому на сьогоднішній день лише кілька комерційних продуктів POCT, таких як Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat і Rhonda, були успішно представлені на відкритому ринку.
У цій статті ми пропонуємо пневматичний мікрофлюїдний привід на основі технології зеленого кільця мікроперемикача (FAST).FAST поєднує всі необхідні властивості одночасно для широкого діапазону реагентів від мікролітрів до мілілітрів.FAST складається з еластичних мембран, важелів і блоків.Без застосування тиску повітря мембрани, важелі та блоки можуть бути щільно закриті, а рідина всередині може зберігатися протягом тривалого часу.Коли застосовується відповідний тиск і регулюється відповідно до довжини важеля, діафрагма розширюється і штовхає важіль у відкрите положення, дозволяючи рідині проходити крізь нього.Це дозволяє багатофункціонально дозувати рідини каскадним, одночасним, послідовним або вибірковим способом.
Ми розробили систему ПЛР з використанням FAST для отримання результатів відповіді у зразку для виявлення вірусів грипу А та В (IAV та IBV).Ми досягли нижньої межі виявлення (LOD) 102 копій/мл, наш мультиплексний аналіз показав специфічність для IAV та IBV і дозволив визначити патотип вірусу грипу.Результати клінічного тестування з використанням зразка мазка з носа від 18 пацієнтів і 18 здорових осіб показують хорошу відповідність інтенсивності флуоресценції зі стандартною RT-PCR (коефіцієнти Пірсона > 0,9).Результати клінічного тестування з використанням зразка мазка з носа від 18 пацієнтів і 18 здорових осіб показують хорошу відповідність інтенсивності флуоресценції зі стандартною RT-PCR (коефіцієнти Пірсона > 0,9).Результати клінічних випробувань з використанням зразка мазка з носа у 18 пацієнтів і 18 здорових осіб показали хорошу відповідність інтенсивності флуоресценції стандартної ОТ-ПЦР (коефіцієнти Пірсона > 0,9).Результати клінічних випробувань з використанням зразка мазка з носа 18 пацієнтів і 18 здорових осіб показують хорошу відповідність між інтенсивністю флуоресценції стандартної RT-PCR (коефіцієнти Пірсона > 0,9).0,9)…………………………………………………………………………………………….. Результати клінічних випробувань із застосуванням зразків назальних мазків у 18 пацієнтів і 18 здорових пацієнтів показали хорошу відповідність між інтенсивністю флуоресценції та стандартним ОТ-ПЦР (коефіцієнт Пірсона > 0,9).Результати клінічних досліджень із застосуванням зразків мазків з носа 18 пацієнтів і 18 здорових осіб показали хорошу відповідність між інтенсивністю флуоресценції та стандартною RT-PCR (коефіцієнт Пірсона > 0,9).Орієнтовна вартість матеріалу пристрою FAST-POCT становить приблизно 1 долар США (додаткова таблиця 1) і може бути додатково зменшена за допомогою широкомасштабних методів виробництва (наприклад, лиття під тиском).Насправді пристрої POCT на основі FAST мають усі необхідні функції, визначені ВООЗ, і сумісні з новими методами біохімічного тестування, такими як термоциклування плазми44, імунологічні аналізи без ампліфікації45 та тести функціональності нанотіл46, які є основою систем POCT.можливість.
На рис.1а показана структура платформи FAST-POCT, яка складається з чотирьох рідинних камер: камери попереднього зберігання, камери змішування, реакційної камери та камери відходів.Ключем до контролю потоку рідини є конструкція FAST (складається з еластичних мембран, важелів і блоків), розташована в камері попереднього зберігання та камері змішування.Будучи методом із пневматичним приводом, конструкція FAST забезпечує точне керування потоком рідини, включаючи перемикання закрито/відкрито, універсальне дозування, випуск рідини за вимогою, надійну роботу (наприклад, нечутливість до вібрації навколишнього середовища) і тривале зберігання.Платформа FAST-POCT складається з чотирьох шарів: опорного шару, шару еластичної плівки, шару пластикової плівки та покривного шару, як показано в збільшеному вигляді на рис. 1b (також детально показано на додаткових малюнках S1 і S2). ).Усі канали та камери транспортування рідини (такі як камери попереднього зберігання та реакційні камери) вбудовані в субстрати PLA (полімолочна кислота) товщиною від 0,2 мм (найтонша частина) до 5 мм.Еластичний плівковий матеріал являє собою PDMS товщиною 300 мкм, який легко розширюється під час застосування тиску повітря завдяки своїй «тонкій товщині» та низькому модулю пружності (приблизно 2,25 МПа47).Шар поліетиленової плівки виготовлений з поліетилентерефталату (ПЕТ) товщиною 100 мкм для захисту еластичної плівки від надмірної деформації під впливом тиску повітря.Відповідно до камер, шар підкладки має важелі, з’єднані з покривним шаром (виготовленим з PLA) шарнірами для контролю потоку рідини.Еластична плівка була приклеєна до шару підкладки за допомогою двосторонньої клейкої стрічки (ARseal 90880) і покрита пластиковою плівкою.Три шари були зібрані на підкладці за допомогою конструкції Т-подібного затиску в покривному шарі.Т-образний затискач має зазор між двома ніжками.Коли затиск було вставлено в паз, дві ніжки злегка зігнулися, а потім повернулися у вихідний стан і щільно зв’язали кришку та підкладку, коли вони проходили через паз (додатковий рис. S1).Потім чотири шари збираються за допомогою з’єднувачів.
Схематична діаграма платформи, що ілюструє різні функціональні відсіки та особливості FAST.b Збільшена схема платформи FAST-POCT.c Фотографія платформи біля монети в чверть долара США.
Робочий механізм платформи FAST-POCT показано на малюнку 2. Ключовими компонентами є блоки на базовому шарі та шарніри на покривному шарі, що призводить до інтерференційної конструкції, коли чотири шари зібрані за допомогою Т-подібної форми. .Коли тиск повітря не застосовується (рис. 2а), посадка з натягом спричиняє згинання та деформацію петлі, і зусилля ущільнення прикладається через важіль, щоб притиснути еластичну плівку до блоку, і рідина в порожнині ущільнення визначається як запечатаний стан.Слід зазначити, що в цьому стані важіль зігнутий назовні, як показано на виді збоку на рис. 2а.Коли подається повітря (рис. 2b), еластична мембрана розширюється назовні в напрямку кришки і штовхає важіль вгору, таким чином відкриваючи зазор між важелем і блоком для надходження рідини в наступну камеру, яка визначається як відкритий стан .Після скидання тиску повітря важіль може повертатися у вихідне положення і залишатися герметичним завдяки еластичності шарніра.Відео рухів важеля представлено в додатковому фільмі S1.
A. Схематична діаграма та фотографії в закритому стані.При відсутності тиску важіль притискає мембрану до блоку, і рідина перекривається.b У хорошому стані.Коли діє тиск, мембрана розширюється і штовхає важіль вгору, таким чином канал відкривається і рідина може текти.c Визначити характерну величину критичного тиску.Характерні розміри включають довжину важеля (L), відстань між повзуном і шарніром (l) і товщину виступу важеля (t).Fs – сила ущільнення в дросельній точці B. q – рівномірно розподілене навантаження на важіль.Tx* представляє крутний момент, який розвиває шарнірний важіль.Критичний тиск - це тиск, необхідний для того, щоб підняти важіль і забезпечити потік рідини.d Теоретичні та експериментальні результати співвідношення між критичним тиском і розміром елемента.n = 6 незалежних експериментів було проведено, і дані показані як ± стандартне відхилення.Необроблені дані представлені у вигляді файлів необроблених даних.
Розроблено аналітичну модель на основі балкової теорії для аналізу залежності критичного тиску Pc, при якому відкривається зазор, від геометричних параметрів (наприклад, L – довжина важеля, l – відстань між блоком і зазором). шарнір, S – важіль. Площа контакту з рідиною t – товщина виступу важеля, як показано на рис. 2c).Як зазначено в додаткових примітках і на додатковому малюнку S3, розрив відкривається, коли \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), де Fs — крутний момент \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\), щоб усунути сили, пов’язані з посадкою з натягом, і спричинити згин шарніра.Експериментальний відгук і аналітична модель показують хорошу згоду (рис. 2d), показуючи, що критичний тиск Pc зростає зі збільшенням t/l і зменшенням L, що легко пояснити класичною балковою моделлю, тобто крутний момент зростає з t /Lift .Таким чином, наш теоретичний аналіз чітко показує, що критичний тиск можна ефективно контролювати, регулюючи довжину важеля L і співвідношення t/l, що забезпечує важливу основу для розробки платформи FAST-POCT.
Платформа FAST-POCT забезпечує багатофункціональне дозування (показано на малюнку 3a з вставкою та експериментом), що є найважливішою особливістю успішної POCT, коли рідини можуть текти в будь-якому напрямку та в будь-якому порядку (каскад, одночасний, послідовний) або вибірково багатоканальний дозування .– функція дозування.На рис.3a(i) показує режим каскадного дозування, в якому дві або більше камер з’єднані каскадом за допомогою блоків для розділення різних реагентів і важеля для керування відкритим і закритим станами.При застосуванні тиску рідина тече з верхньої камери в нижню каскадом.Слід зазначити, що каскадні камери можна заповнювати вологими хімікатами або сухими хімікатами, такими як ліофілізовані порошки.В експерименті на рис. 3a(i) червоне чорнило з верхньої камери тече разом із синім порошком барвника (мідним купоросом) у другу камеру і стає темно-синім, коли досягає нижньої камери.Він також показує контрольний тиск рідини, що перекачується.Подібним чином, коли один важіль підключений до двох камер, це стає режимом одночасного впорскування, як показано на рис.3a(ii), в якому рідина може бути рівномірно розподілена по двох або більше камерах під час застосування тиску.Оскільки критичний тиск залежить від довжини важеля, довжину важеля можна регулювати, щоб досягти послідовного впорскування, як показано на рис.3a(iii).Довгий важіль (з критичним тиском Pc_long) було з’єднано з камерою B, а короткий важіль (з критичним тиском Pc_short > Pc_long) було з’єднано з камерою A. Оскільки застосовувався тиск P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), лише рідина червоного кольору може надходити в камеру B, а коли тиск було підвищено до P2 (> Pc_short), блакитна рідина може надходити в камеру A. Цей послідовний режим впорскування застосовується до різних рідин, які послідовно переходять у відповідні камери, що є критичним для успішної POCT пристрій.Довгий важіль (з критичним тиском Pc_long) було з’єднано з камерою B, а короткий важіль (з критичним тиском Pc_short > Pc_long) було з’єднано з камерою A. Оскільки застосовувався тиск P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), лише рідина червоного кольору може надходити в камеру B, а коли тиск було підвищено до P2 (> Pc_short), блакитна рідина може надходити в камеру A. Цей послідовний режим впорскування застосовується до різних рідин, які послідовно переходять у відповідні камери, що є критичним для успішної POCT пристрій.Длинний ричаг (з критичним тиском Pc_long) був з'єднаний з камерою B, а короткий ричаг (з критичним тиском Pc_short > Pc_long) був з'єднаний з камерою A. При накладенні тиску P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) тільки рідина, виділена червоним може бути течією в камеру B, і коли тиск збільшився до P2 (> Pc_short), синя рідина може текти в камері A. Цей режим послідовного введення застосовується до різних рідин, які послідовно переміщуються в відповідні камери, що має вирішальне значення для успішної POCT.Довгий важіль (з критичним тиском Pc_long) був підключений до камери B, а короткий важіль (з критичним тиском Pc_short > Pc_long) був підключений до камери A. Коли застосовується тиск P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), підсвічується лише рідина червоний колір може надходити в камеру B, а коли тиск підвищується до P2 (> Pc_short), синя рідина може надходити в камеру A. Цей режим послідовного впорскування застосовується до різних рідин, які послідовно передаються у відповідні камери, що є критичним. для успішного POCT.пристрій. Длинний ричаг (критичне тиск Pc_long) з’єднаний з камерою B, а короткий ричаг (критичне тиск Pc_short > Pc_long) з’єднаний з камерою A.Довге плече (критичний тиск Pc_long) з’єднане з камерою B, а коротке плече (критичний тиск Pc_short > Pc_long) з’єднане з камерою A.При застосуванні тиску P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) в камері B може діяти тільки червона рідина, а при підвищенні тиску до P2 (> Pc_short) в камері A може діяти синя рідина.Коли застосовується тиск P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), тільки червона рідина може потрапити в камеру B, а коли тиск підвищується до P2 (> Pc_short), синя рідина може потрапити в камеру A. Цей режим послідовного впорскування підходить для послідовного перенесення різні рідини у відповідні камери, що є критичним для успішної роботи пристрою POCT.Рисунок 3a(iv) демонструє вибірковий режим впорскування, де головна камера мала короткий (з критичним тиском Pc_short) і довгий важіль (з критичним тиском Pc_long < Pc_short), які були з’єднані з камерою A і камерою B, відповідно, на додаток до іншого повітряного каналу, з’єднаного з камерою B. Щоб спочатку перенести рідину в камеру A, до пристрою одночасно прикладали тиск P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) і P2 (P2 > P1) з P1 + P2 > Pc_short.Рисунок 3a(iv) демонструє вибірковий режим впорскування, де головна камера мала короткий (з критичним тиском Pc_short) і довгий важіль (з критичним тиском Pc_long < Pc_short), які були з’єднані з камерою A і камерою B, відповідно, на додаток до іншого повітряного каналу, з’єднаного з камерою B. Щоб спочатку перенести рідину в камеру A, до пристрою одночасно прикладали тиск P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) і P2 (P2 > P1) з P1 + P2 > Pc_short.На рис.3а(iv) показаний режим селективного притискання, при якому основна камера мала короткий (з критичним тиском Pc_short) і довгий ричаг (з критичним тиском Pc_long < Pc_short), які додатково з’єднувалися з камерою A і камерою B відповідно.3a(iv) показує режим селективного впорскування, в якому головна камера мала короткий (з критичним тиском Pc_short) і довгий важіль (з критичним тиском Pc_long < Pc_short), які були додатково з’єднані з камерою A і камерою B відповідно.до другого повітряного каналу, з’єднаного з камерою B. Щоб спочатку перевести рідину в камеру A, до пристрою одночасно приклали тиск P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) і P2 (P2 > P1), де P1 + P2 > Pc_short.до іншого повітряного каналу, з’єднаного з камерою B. Щоб спочатку перенести рідину в камеру A, тиск P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) і P2 (P2 > P1) були одночасно застосовані до пристрою, де P1 + P2 > Pc_short. 3а(iv) показаний режим селективного втягування, коли основна камера має короткий стержень (з критичним тиском Pc_short) і довгий стержень (з критичним тиском Pc_long < Pc_short), з’єднані з камерою A і камерою B відповідно, і в доповненні до іншого повітряного каналу, підключеному до кімнати Б.3a(iv) показує вибірковий режим впорскування, коли головна камера має короткий шток (критичний тиск Pc_short) і довгий шток (критичний тиск Pc_long < Pc_short), з’єднані відповідно з камерою A та камерою B, і на додаток до іншого повітряного проходу, підключений до кімнати B.Таким чином, P2 запобігає потраплянню рідини в камеру B;тим часом загальний тиск P1 + P2 перевищив критичний тиск для активації коротшого важеля, з’єднаного з камерою A, щоб забезпечити потік рідини в камеру A. Тоді, коли потрібно було заповнити камеру B, нам потрібно лише застосувати P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) у головній камері, щоб активувати довгий важіль і дозволити рідині текти до камери B. Можна чітко спостерігати з часу t = 3 с до 9 с, що рідина в камері A залишалася постійною, тоді як вона збільшувалася в камері B при застосуванні тиску P1.тим часом загальний тиск P1 + P2 перевищив критичний тиск для активації коротшого важеля, з’єднаного з камерою A, щоб забезпечити потік рідини в камеру A. Тоді, коли потрібно було заповнити камеру B, нам потрібно лише застосувати P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) у головній камері, щоб активувати довгий важіль і дозволити рідині текти до камери B. Можна чітко спостерігати з часу t = 3 с до 9 с, що рідина в камері A залишалася постійною, тоді як вона збільшувалася в камері B при застосуванні тиску P1.Між тим, загальний тиск P1 + P2 перевищив критичний тиск, щоб активувати більш короткий ричаг, з'єднаний з камерою A, щоб дозволити рідини течі в камеру A. Потім, коли потрібно заповнити камеру B, нам потрібно тільки застосувати P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) в основній камері, щоб активувати довгий ричаг і дати рідину течі в камеру B. Можна ясно спостерігати, що в період з t = 3 с до 9 с рідина в камері A залишалася постійною, в той час як в камері вона збільшилася.Тим часом загальний тиск P1 + P2 перевищив критичний тиск, щоб активувати коротший важіль, з’єднаний з камерою A, щоб дозволити рідині текти в камеру A. Тоді, коли камеру B потрібно заповнити, нам потрібно лише застосувати P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) у головній камері, щоб активувати довгий важіль і дозволити рідині текти в камеру B. Можна чітко спостерігати, що між t = 3 с і 9 с рідина в камері A залишалася постійною, тоді як у камері вона збільшувалася.B при застосуванні тиску P1.У той же час загальний тиск P1 + P2 перевищує критичний тиск, приводячи в дію більш короткий важіль, що з’єднує камеру A, дозволяючи рідині надходити в камеру A.Коли приходить час заповнити камеру A, ми просто наносимо P1 в основну камеру та P2 у допоміжну камеру.Таким чином, поведінку потоку можна вибірково перемикати між камерами A та B. Поведінку потоку чотирьох багатофункціональних режимів розподілу можна знайти в додатковому фільмі S2.
a Ілюстрація багатофункціонального призначення, тобто (i) каскадного, (ii) одночасного, (iii) послідовного та (iv) вибіркового призначення.Криві представляють робочий процес і параметри цих чотирьох режимів розподілу.b Результати випробувань тривалого зберігання в деіонізованій воді та етанолі.n = 5 незалежних експериментів було проведено, і дані показані як ± sd c.Демонстрація випробування стабільності, коли пристрій FAST і капілярний клапан (CV) перебували в (i) статичному та (ii) вібраційному станах.(iii) Залежність об’єму від часу для пристроїв FAST і CV на різних кутових частотах.d Публікація результатів випробувань на вимогу для (i) пристрою FAST та (ii) пристрою CV.(iii) Зв’язок між об’ємом і часом для пристроїв FAST і CV, що використовують режим переривчастого тиску.Всі шкали, 1 см.Необроблені дані надаються як файли необроблених даних.
Тривале зберігання реагентів є ще однією важливою особливістю успішного пристрою POCT, який дозволить ненавченому персоналу працювати з кількома реагентами.Хоча багато технологій показали свій потенціал для тривалого зберігання (наприклад, 35 мікродиспенсерів, 48 блістерів і 49 стіків), для розміщення упаковки потрібне спеціальне приймальне відділення, що збільшує вартість і складність;крім того, ці механізми зберігання не дозволяють роздавати за вимогою і призводять до втрати реагентів через залишки в упаковці.Можливість тривалого зберігання була перевірена шляхом проведення прискореного випробування терміну експлуатації з використанням матеріалу ПММА, обробленого на станках з ЧПУ, завдяки його невеликій шорсткості та стійкості до проникнення газу (додатковий малюнок S5).Тестовий апарат заповнювали деіонізованою водою (деіонізованою водою) і 70% етанолом (імітують летючі реагенти) при 65°C протягом 9 днів.І деіонізовану воду, і етанол зберігали за допомогою алюмінієвої фольги, щоб заблокувати доступ зверху.Рівняння Арреніуса та енергія активації проникнення, описані в літературі50,51, використовувалися для розрахунку еквівалента в реальному часі.На рис.3b показано середні результати втрати ваги для 5 зразків, які зберігалися при 65°C протягом 9 днів, що еквівалентно 0,30% для деіонізованої води та 0,72% для 70% етанолу протягом 2 років при 23°C.
На рис.3c показано випробування на вібрацію.Оскільки капілярний клапан (CV) є найпопулярнішим методом обробки рідин серед існуючих пристроїв POCT28,29, для порівняння використовувався пристрій CV шириною 300 мкм і глибиною 200 мкм.Можна побачити, що коли обидва пристрої залишаються нерухомими, рідина в платформі FAST-POCT ущільнюється, а рідина в пристрої CV блокується через раптове розширення каналу, що зменшує капілярні сили.Однак із збільшенням кутової частоти орбітального вібратора рідина в платформі FAST-POCT залишається герметичною, але рідина в пристрої CV тече в нижню камеру (див. також додатковий фільм S3).Це свідчить про те, що деформівні петлі платформи FAST-POCT можуть прикладати сильну механічну силу до модуля, щоб щільно закрити рідину в камері.Однак у пристроях CV рідина утримується через баланс між твердою, повітряною та рідкою фазами, створюючи нестабільність, а вібрації можуть порушити баланс і спричинити неочікувану поведінку потоку.Перевага платформи FAST-POCT полягає в тому, що вона забезпечує надійну функціональність і дозволяє уникнути збоїв за наявності вібрації, яка зазвичай виникає під час доставки та експлуатації.
Іншою важливою особливістю платформи FAST-POCT є її випуск за вимогою, що є ключовою вимогою для кількісного аналізу.На рис.3d порівнює випуск на вимогу платформи FAST-POCT і пристрою CV.З рис.3d(iii) ми бачимо, що пристрій FAST швидко реагує на сигнал тиску.Коли на платформу FAST-POCT було застосовано тиск, рідина потекла, коли тиск було скинуто, потік негайно припинився (рис. 3d(i)).Таку дію можна пояснити швидким пружним поверненням шарніра, який притискає важіль назад до блоку, закриваючи камеру.Однак рідина продовжувала текти в пристрої CV, що зрештою призвело до неочікуваного об’єму рідини приблизно 100 мкл після скидання тиску (рис. 3d(ii) і додатковий фільм S4).Це можна пояснити зникненням ефекту капілярного закріплення при повному змочуванні КВ після першої ін’єкції.
Здатність працювати з рідинами різної змочуваності та в’язкості в одному пристрої залишається проблемою для застосувань POCT.Погана змочуваність може призвести до витоків або іншої несподіваної поведінки потоку в каналах, і допоміжне обладнання, таке як вихрові змішувачі, центрифуги та фільтри, часто потрібне для приготування високов’язких рідин 52 .Ми перевірили зв’язок між критичним тиском і властивостями рідини (з широким діапазоном змочуваності та в’язкості).Результати наведено в таблиці 1 і відео S5.Можна побачити, що рідини різної змочуваності та в’язкості можуть бути герметизовані в камері, і при застосуванні тиску навіть рідини з в’язкістю до 5500 сП можуть бути перенесені в сусідню камеру, що робить можливим виявлення зразків з високою в'язкість (тобто мокротиння, дуже в'язкий зразок, який використовується для діагностики респіраторних захворювань).
Об’єднавши зазначені вище багатофункціональні пристрої дозування, можна розробити широкий спектр пристроїв POCT на основі FAST.Приклад показано на малюнку 1. Установка містить камеру попереднього зберігання, камеру змішування, реакційну камеру та камеру відходів.Реагенти можна зберігати в камері попереднього зберігання протягом тривалого періоду часу, а потім вивантажувати в камеру змішування.При правильному тиску змішані реагенти можна вибірково перенести в камеру відходів або реакційну камеру.
Оскільки ПЛР-виявлення є золотим стандартом для виявлення таких збудників, як H1N1 і COVID-19, і передбачає кілька етапів реакції, ми використали платформу FAST-POCT для ПЛР-виявлення як додаток.На рис.4 показано процес ПЛР-тестування за допомогою платформи FAST-POCT.Спочатку елююючий реагент, реагент для магнітних мікрокульок, промивний розчин A та промивний розчин W піпетували в камери попереднього зберігання E, M, W1 і W2 відповідно.Етапи адсорбції РНК показано на рис.4a і є такими: (1) коли прикладається тиск P1 (=0,26 бар), зразок переміщується в камеру M і вивантажується в камеру змішування.(2) Тиск повітря P2 (= 0,12 бар) подається через порт A, підключений до дна змішувальної камери.Незважаючи на те, що низка методів змішування показала свій потенціал у змішуванні рідин на платформах POCT (наприклад, серпантинне змішування 53, випадкове змішування 54 і періодичне змішування 55), ефективність і ефективність їх змішування все ще незадовільні.Він застосовує метод бульбашкового змішування, при якому повітря вводиться в нижню частину змішувальної камери для створення бульбашок у рідині, після чого потужний вихор може досягти повного змішування за лічені секунди.Були проведені експерименти зі змішуванням бульбашок, і результати представлені на додатковому малюнку S6.Можна побачити, що при застосуванні тиску 0,10 бар повне змішування займає приблизно 8 секунд.При збільшенні тиску до 0,20 бар повне змішування досягається приблизно за 2 секунди.Методи розрахунку ефективності змішування представлені в розділі Методи.(3) Використовуйте рубідієвий магніт, щоб витягти кульки, потім створіть тиск P3 (= 0,17 бар) через порт P, щоб перемістити реагенти в камеру для відходів.На рис.4b,c показує етапи промивання для видалення домішок із зразка наступним чином: (1) Промивний розчин А з камери W1 вивантажується в камеру змішування під тиском P1.(2) Потім виконайте процес бульбашкового змішування.(3) Промивний розчин A переміщується в камеру для відпрацьованої рідини, а мікрокульки в змішувальній камері витягуються магнітом.Промивання W (рис. 4c) було подібне до промивання A (рис. 4b).Слід зазначити, що кожну стадію промивання A і W проводили двічі.На рисунку 4d показано етапи елюції для елюції РНК із кульок;стадії введення елюції та змішування такі ж, як описані вище стадії адсорбції та промивання РНК.Коли елююючі реагенти переносяться в реакційну камеру ПЛР під тиском P3 і P4 (=0,23 бар), досягається критичний тиск для герметизації рукава реакційної камери ПЛР.Подібним чином тиск P4 також допомагає закрити прохід до камери для відходів.Таким чином, усі елююючі реагенти були рівномірно розподілені між чотирма реакційними камерами ПЛР для ініціації реакцій мультиплексної ПЛР.Наведена вище процедура представлена в додатковому фільмі S6.
На етапі адсорбції РНК зразок вводять у вхідний отвір М і вводять у змішувальну камеру разом із попередньо збереженим розчином кульок.Після змішування та видалення гранул реагенти розподіляються в камеру для відходів.На етапах промивання b і c введіть різні попередньо збережені реагенти для промивання в камеру змішування, а після змішування та видалення кульок перемістіть реагенти в камеру для відпрацьованої рідини.d Етап елюювання: після введення реагентів для елюювання, змішування та екстракції кульок реагенти переносяться в реакційну камеру ПЛР.Криві показують робочий процес і відповідні параметри різних етапів.Тиск - це тиск, який чиниться через окремі камери.Об'єм - це об'єм рідини в камері змішування.Усі шкали дорівнюють 1 см.Необроблені дані надаються як файли необроблених даних.
Було проведено процедуру ПЛР-тестування, і на додатковому малюнку S7 представлені термічні профілі, включаючи 20 хвилин часу зворотної транскрипції та 60 хвилин часу термічного циклу (95 і 60 °C), причому один тепловий цикл становить 90 с (додатковий фільм S7)..FAST-POCT вимагає менше часу для завершення одного термоциклу (90 секунд), ніж звичайна RT-PCR (180 секунд для одного термоциклу).Це можна пояснити високим співвідношенням площі поверхні до об’єму та низькою тепловою інерцією реакційної камери мікроПЛР.Поверхня камери становить 96,6 мм2, а об’єм камери – 25 мм3, що робить співвідношення поверхні до об’єму приблизно 3,86.Як видно на додатковому малюнку S10, область ПЛР-тесту нашої платформи має канавку на задній панелі, що робить товщину дна камери ПЛР 200 мкм.До поверхні нагріву терморегулятора прикріплена теплопровідна еластична прокладка, що забезпечує щільний контакт із задньою частиною тест-бокса.Це зменшує теплову інерцію платформи та покращує ефективність нагріву/охолодження.Під час термічного циклу парафін, вбудований у платформу, плавиться та стікає в реакційну камеру ПЛР, діючи як герметик для запобігання випаровуванню реагенту та забрудненню навколишнього середовища (див. Додатковий фільм S8).
Усі процеси ПЛР-детектування, описані вище, були повністю автоматизовані за допомогою виготовленого на замовлення приладу FAST-POCT, що складається з запрограмованого блоку контролю тиску, блоку магнітної екстракції, блоку контролю температури та блоку захоплення та обробки флуоресцентного сигналу.Слід зазначити, що ми використовували платформу FAST-POCT для виділення РНК, а потім використовували екстраговані зразки РНК для ПЛР-реакцій за допомогою системи FAST-POCT і настільної системи ПЛР для порівняння.Результати були майже такими ж, як показано на додатковому малюнку S8.Оператор виконує просте завдання: вводить зразок у М-камеру та вставляє платформу в інструмент.Кількісні результати тесту доступні приблизно через 82 хвилини.Детальну інформацію про інструменти FAST-POCT можна знайти на додатковому малюнку.C9, C10 і C11.
Грип, викликаний вірусами грипу A (IAV), B (IBV), C (ICV) і D (IDV), є поширеним глобальним явищем.З них IAV та IBV спричиняють найважчі випадки та сезонні епідемії, інфікуючи 5-15% населення світу, спричиняючи 3-5 мільйонів важких випадків та спричиняючи 290 000-650 000 смертей щорічно.Захворювання органів дихання56,57.Рання діагностика IAV та IB має важливе значення для зменшення захворюваності та пов’язаного з нею економічного тягаря.Серед доступних діагностичних методів полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскриптазою (RT-PCR) вважається найбільш чутливою, специфічною та точною (>99%)58,59.Серед доступних діагностичних методів полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскриптазою (RT-PCR) вважається найбільш чутливою, специфічною та точною (>99%)58,59.Серед доступних діагностичних методів полімеразна цепна реакція з зворотною транскриптазою (ОТ-ПЦР) вважається найбільш чутливою, специфічною і точною (> 99%)58,59.Серед доступних діагностичних методів найбільш чутливим, специфічним і точним (> 99%) вважається полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскриптазою (RT-PCR)58,59. З доступних діагностичних методів полімеразна реакція зі зворотною транскриптазою (ОТ-ПЦР) вважається найбільш чутливою, специфічною і точною (>99%)58,59.З доступних діагностичних методів найбільш чутливим, специфічним і точним (>99%) вважається зворотна транскриптазна полімеразна ланцюгова реакція (ЗТ-ПЛР)58,59.Однак традиційні методи RT-PCR вимагають повторного піпетування, змішування, дозування та перенесення рідини, що обмежує їх використання професіоналами в умовах обмежених ресурсів.Тут платформу FAST-POCT використовували для ПЛР-детекції IAV та IBV відповідно, щоб отримати їх нижню межу виявлення (LOD).Крім того, IAV та IBV були мультиплексовані для розрізнення різних патотипів у різних видів, забезпечуючи багатообіцяючу платформу для генетичного аналізу та можливість точного лікування захворювання.
На рис.5а показані результати ПЛР-тестування HAV з використанням 150 мкл очищеної вірусної РНК як зразка.На рис.5a(i) показує, що при концентрації HAV 106 копій/мл інтенсивність флуоресценції (ΔRn) може досягати 0,830, а коли концентрація знижується до 102 копій/мл, ΔRn все ще може досягати 0,365, що відповідає вищому показнику групи порожнього негативного контролю (0,002), приблизно в 100 разів вище.Для кількісного визначення на основі шести незалежних експериментів була створена лінійна калібрувальна крива між логарифмічної концентрацією та порогом циклу (Ct) IAV (рис. 5a(ii)), R2 = 0,993, в діапазоні від 102-106 копій/мл.результати добре узгоджуються зі звичайними методами RT-PCR.На рис.5a(iii) показані флуоресцентні зображення результатів тесту після 40 циклів платформи FAST-POCT.Ми виявили, що платформа FAST-POCT може виявити HAV лише за 102 копії/мл.Однак традиційний метод не має значення Ct на рівні 102 копії/мл, що робить LOD приблизно 103 копії/мл.Ми припустили, що це може бути пов’язано з високою ефективністю бульбашкового змішування.Експерименти ПЛР-тесту проводили на очищеній РНК IAV для оцінки різних методів змішування, включаючи змішування струшуванням (той самий метод змішування, що й у звичайній операції RT-PCR), змішування у флаконі (цей метод, 3 с при 0,12 бар) і відсутність змішування в якості контрольної групи ..Результати можна знайти на додатковому малюнку S12.Можна побачити, що при вищій концентрації РНК (106 копій/мл) значення Ct для різних методів змішування майже такі ж, як і для бульбашкового змішування.Коли концентрація РНК впала до 102 копій/мл, суміш для струшування та контролі не мали значень Ct, тоді як метод бульбашкового змішування все ще давав значення Ct 36,9, що було нижче порогового значення Ct 38. Результати показують домінуючу характеристику змішування везикул, що також було продемонстровано в іншій літературі, що також може пояснити, чому чутливість платформи FAST-POCT трохи вища, ніж звичайна RT-PCR.На рис.5b показані результати ПЛР-аналізу очищених зразків РНК IBV в діапазоні від 101 до 106 копій/мл.Результати були подібні до тесту IAV, досягаючи R2 = 0,994 і LOD 102 копії/мл.
ПЛР-аналіз вірусу грипу А (IAV) з концентраціями IAV від 106 до 101 копій/мл з використанням буфера TE як негативного контролю (NC).(i) Крива флуоресценції в реальному часі.(ii) Лінійна калібрувальна крива між логарифмічною концентрацією IAV РНК і порогом циклу (Ct) для FAST і звичайних методів тестування.(iii) Флуоресцентне зображення IAV FAST-POCT після 40 циклів.b, виявлення ПЛР вірусу грипу B (IBV) з (i) спектром флуоресценції в реальному часі.(ii) Лінійна калібрувальна крива та (iii) флуоресцентне зображення FAST-POCT IBV після 40 циклів.Нижня межа виявлення (LOD) для IAV та IBV за допомогою платформи FAST-POCT становила 102 копії/мл, що нижче, ніж звичайні методи (103 копії/мл).c Результати мультиплексного тесту на IAV та IBV.GAPDH використовували як позитивний контроль, а буфер TE використовували як негативний контроль, щоб запобігти можливому забрудненню та фоновому посиленню.Можна виділити чотири різні типи зразків: (1) негативні зразки лише для GAPDH («IAV-/IBV-»);(2) IAV-інфекція («IAV+/IBV-») з IAV та GAPDH;(3) інфекція IBV («IAV-/IBV+») з IBV та GAPDH;(4) Інфекція IAV/IBV («IAV+/IBV+») з IAV, IBV та GAPDH.Пунктирна лінія позначає порогову лінію.n = 6 біологічно незалежних експериментів було проведено, дані наведені як ± стандартне відхилення.Необроблені дані представлені у вигляді файлів необроблених даних.
На рис.5c показує результати тесту мультиплексування для IAV/IBV.Тут лізат вірусу використовувався як розчин зразка замість очищеної РНК, і чотири праймери для IAV, IBV, GAPDH (позитивний контроль) і буфер TE (негативний контроль) були додані до чотирьох різних реакційних камер платформи FAST-POCT.Тут використовуються позитивні та негативні контролі, щоб запобігти можливому забрудненню та покращенню фону.Тести були розділені на чотири групи: (1) GAPDH-негативні зразки («IAV-/IBV-»);(2) інфіковані IAV («IAV+/IBV-») проти IAV та GAPDH;(3) IBV-.інфіковані (“IAV-”) -/IBV+”) IBV та GAPDH;(4) IAV/IBV («IAV+/IBV+») інфекція IAV, IBV та GAPDH.На рис.5c показано, що коли застосовували негативні зразки, інтенсивність флуоресценції ΔRn камери позитивного контролю становила 0,860, а ΔRn IAV та IBV була подібною до негативного контролю (0,002).Для груп IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ та IAV+/IBV+ камери IAV/GAPDH, IBV/GAPDH та IAV/IBV/GAPDH показали значну інтенсивність флуоресценції відповідно, тоді як інші камери навіть показали інтенсивність флуоресценції на фоні рівень 40 після термоциклування.Виходячи з наведених вище тестів, платформа FAST-POCT показала виняткову специфічність і дозволила нам одночасно визначити патотип різних вірусів грипу.
Щоб підтвердити клінічну застосовність FAST-POCT, ми протестували 36 клінічних зразків (зразки мазків з носа) від пацієнтів із ВХ (n=18) та контрольної групи без ВХ (n=18) (Рисунок 6а).Інформація про пацієнта представлена в додатковій таблиці 3. Інфекційний статус IB було незалежно підтверджено, а протокол дослідження схвалено першою афілійованою лікарнею Чжецзянського університету (Ханчжоу, Чжецзян).Кожна вибірка пацієнтів була розділена на дві категорії.Один був оброблений за допомогою FAST-POCT, а інший – за допомогою настільної системи ПЛР (SLAN-96P, Китай).Обидва аналізи використовують однакові набори для очищення та виявлення.На рис.6b показує результати FAST-POCT і звичайної ПЛР зі зворотною транскрипцією (RT-PCR).Ми порівняли інтенсивність флуоресценції (FAST-POCT) з -log2(Ct), де Ct є пороговим значенням циклу для звичайної RT-PCR.Між двома методами було добре узгоджено.FAST-POCT і RT-PCR показали сильну позитивну кореляцію зі значенням коефіцієнта Пірсона (r) 0,90 (рис. 6b).Потім ми оцінили діагностичну точність FAST-POCT.Розподіл інтенсивності флуоресценції (FL) для позитивних і негативних зразків надано як незалежний аналітичний показник (рис. 6c).Значення FL були значно вищими у хворих на ВХ, ніж у контрольній групі (****P = 3,31 × 10-19; двосторонній t-критерій) (рис. 6d).Далі були побудовані криві робочих характеристик приймача IBV (ROC).Ми виявили, що діагностична точність була дуже хорошою, з площею під кривою 1 (рис. 6e).Зауважте, що через обов’язкове замовлення масок у Китаї через COVID-19 станом на 2020 рік ми не виявили пацієнтів із ЗЗК, тому всі позитивні клінічні зразки (тобто зразки мазків з носа) стосувалися лише IBV.
Дизайн клінічного дослідження.Загалом 36 зразків, у тому числі 18 зразків пацієнтів і 18 контрольних зразків, не хворих на грип, були проаналізовані за допомогою платформи FAST-POCT і традиційної RT-PCR.b Оцініть аналітичну узгодженість між методом FAST-POCT PCR і звичайною RT-PCR.Результати позитивно корелюють (Пірсон r = 0,90).c Рівні інтенсивності флуоресценції у 18 пацієнтів із ВХ та 18 контрольних.d У хворих на ВХ (+) значення FL були значно вищими, ніж у контрольній групі (-) (****P = 3,31 × 10-19; двобічний t-критерій; n = 36).Для кожної квадратної діаграми чорний маркер у центрі представляє медіану, а нижня та верхня лінії прямокутника представляють 25-й та 75-й процентилі відповідно.Вуса простягаються до мінімальних і максимальних точок даних, які не вважаються викидами.e крива ROC.Пунктирна лінія d представляє порогове значення, оцінене з аналізу ROC.AUC для IBV становить 1. Необроблені дані надаються у вигляді файлів необроблених даних.
У цій статті ми представляємо FAST, який має характеристики, необхідні для ідеального POCT.Переваги нашої технології включають: (1) універсальне дозування (каскадне, одночасне, послідовне та вибіркове), випуск за потребою (швидке та пропорційне скидання прикладеного тиску) та надійну роботу (вібрація при 150 градусах) (2) тривале зберігання (2 роки прискореного тестування, втрата ваги близько 0,3%);(3) можливість роботи з рідинами з широким діапазоном змочуваності та в'язкості (в'язкість до 5500 сП);(4) Економічність (Орієнтовна вартість матеріалу пристрою FAST-POCT PCR становить приблизно 1 долар США).Комбінуючи багатофункціональні диспенсери, було продемонстровано та застосовано інтегровану платформу FAST-POCT для ПЛР-детекції вірусів грипу А та В.FAST-POCT займає лише 82 хвилини.Клінічні випробування з 36 зразками мазків з носа показали хорошу відповідність інтенсивності флуоресценції зі стандартною RT-PCR (коефіцієнти Пірсона > 0,9).Клінічні випробування з 36 зразками мазків з носа показали хорошу відповідність інтенсивності флуоресценції зі стандартною RT-PCR (коефіцієнти Пірсона > 0,9).Клінічні тести з 36 зразками мазків з носа показали хорошу відповідність інтенсивності флуоресценції стандартної ОТ-ПЦР (коефіцієнти Пірсона > 0,9).Клінічні випробування 36 зразків мазків з носа показали хорошу відповідність інтенсивності флуоресценції стандартної RT-PCR (коефіцієнти Пірсона > 0,9).RT-PCR Клінічні випробування 36 зразків мазків із носа показали хороше зниження інтенсивності флуоресценції зі стандартною ОТ-ПЦР (коефіцієнт Пірсона > 0,9).Клінічне тестування 36 зразків мазків з носа показало хорошу відповідність інтенсивності флуоресценції стандартній RT-PCR (коефіцієнт Пірсона > 0,9).Паралельно з цією роботою різні нові біохімічні методи (наприклад, термічний цикл плазми, імуноаналізи без ампліфікації та аналізи функціональності нанотіл) показали свій потенціал у POCT.Однак через відсутність повністю інтегрованої та надійної платформи POCT ці методи неминуче вимагають окремих процедур попередньої обробки (наприклад, виділення РНК44, інкубація45 та промивання46), що додатково доповнює поточну роботу з цими методами для реалізації розширених функцій POCT за допомогою необхідні параметри.продуктивність вибірки-відповіді-виведення.У цій роботі, хоча повітряний насос, який використовується для активації клапана FAST, досить малий, щоб його можна було інтегрувати в настільний прилад (рис. S9, S10), він все одно споживає значну потужність і створює шум.В принципі, пневматичні насоси меншого форм-фактора можна замінити іншими засобами, такими як використання електромагнітної сили або приведення в дію пальцем.Подальші вдосконалення можуть включати, наприклад, адаптацію наборів для різних і специфічних біохімічних аналізів, використання нових методів виявлення, які не вимагають систем нагрівання/охолодження, таким чином забезпечуючи безінструментальну платформу POCT для застосування ПЛР.Ми вважаємо, що враховуючи те, що платформа FAST забезпечує спосіб маніпулювання рідинами, ми вважаємо, що запропонована технологія FAST представляє потенціал для створення спільної платформи не лише для біомедичних тестів, але й для моніторингу навколишнього середовища, тестування якості харчових продуктів, синтезу матеріалів і ліків ..
Збір і використання зразків мазка з носа людини схвалено Комітетом з етики першої афілійованої лікарні Чжецзянського університету (IIT20220330B).Було зібрано 36 зразків мазків з носа, в яких взяли участь 16 дорослих <30 років, 7 дорослих старше 40 років, 19 чоловіків і 17 жінок.Було зібрано 36 зразків мазків з носа, в яких взяли участь 16 дорослих <30 років, 7 дорослих старше 40 років, 19 чоловіків і 17 жінок.Було зібрано 36 зразків мазків із носа, в яких взяли участь 16 дорослих < 30 років, 7 дорослих старше 40 років, 19 чоловіків і 17 жінок.Тридцять шість зразків мазків з носа було зібрано у 16 дорослих <30 років, 7 дорослих старше 40 років, 19 чоловіків і 17 жінок.Демографічні дані представлені в додатковій таблиці 3. Інформована згода була отримана від усіх учасників.Усі учасники мали підозру на грип і пройшли тестування добровільно без компенсації.
Основа та кришка FAST виготовлені з полімолочної кислоти (PLA) і надруковані на 3D-принтері Ender 3 Pro (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).Двосторонній скотч був придбаний у Adhesives Research, Inc. Модель 90880. ПЕТ-плівка товщиною 100 мкм була придбана у McMaster-Carr.І клей, і ПЕТ-плівка були розрізані за допомогою різака Silhouette Cameo 2 від Silhouette America, Inc. Еластична плівка виготовлена з матеріалу PDMS шляхом лиття під тиском.Спочатку ПЕТ-рамку товщиною 200 мкм вирізали за допомогою лазерної системи та приклеїли до листа ПММА товщиною 3 мм за допомогою двосторонньої липкої стрічки товщиною 100 мкм.Попередник PDMS (Sylgard 184; Частина A: Частина B = 10:1, Dow Corning) потім виливали у форму та використовували скляну паличку для видалення надлишку PDMS.Після затвердіння при 70°C протягом 3 годин плівку PDMS товщиною 300 мкм можна було відшаровувати від форми.
Фотографії для різноманітного розповсюдження, публікації на вимогу та надійної роботи зроблені за допомогою високошвидкісної камери (Sony AX700 1000 кадрів/с).Орбітальний шейкер, використаний у тесті на надійність, був придбаний у SCILOGEX (SCI-O180).Тиск повітря створюється повітряним компресором, а для регулювання значення тиску використовується кілька цифрових точних регуляторів тиску.Процес тестування поведінки потоку виглядає наступним чином.Заздалегідь визначену кількість рідини було введено в тестовий пристрій, а високошвидкісна камера використовувалася для запису поведінки потоку.Потім були взяті нерухомі зображення з відео поведінки потоку в фіксований час, а площа, що залишилася, була розрахована за допомогою програмного забезпечення Image-Pro Plus, яку потім помножили на глибину камери для розрахунку об’єму.Деталі системи тестування поведінки потоку можна знайти на додатковому малюнку S4.
Введіть 50 мкл мікрогранулок і 100 мкл деіонізованої води у змішувальний пристрій для флакона.Фотографії змішаної продуктивності робили високошвидкісною камерою кожні 0,1 секунди при тиску 0,1 бар, 0,15 бар і 0,2 бар.Інформацію про пікселі під час процесу змішування можна отримати з цих зображень за допомогою програмного забезпечення для обробки фотографій (Photoshop CS6).Ефективності змішування можна досягти за допомогою наступного рівняння 53.
де M — ефективність змішування, N — загальна кількість пікселів вибірки, а ci та \(\bar{c}\) — нормалізовані та очікувані нормалізовані концентрації.Ефективність змішування коливається від 0 (0%, незмішаний) до 1 (100%, повністю змішаний).Результати показано на додатковому малюнку S6.
Набір RT-PCR у реальному часі для IAV та IBV, включаючи зразки РНК IAV та IBV (кат. № RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, Китай), трис-EDTA буфер (TE буфер № B541019) , Sangon Biotech, Китай), набір для очищення позитивної контрольної РНК (деталь № Z-ME-0010, Liferiver, Китай) і розчин GAPDH (деталь № M591101, Sangon Biotech, Китай) є комерційно доступними.Набір для очищення РНК включає буфер для зв’язування, промивку A, промивку W, елюент, магнітні мікрокульки та акриловий носій.Набори IAV та IBV в реальному часі ПЛР-ЗВТ включають суміш для виявлення нуклеїнової кислоти IFVA та фермент ОТ-ПЛР.Додайте 6 мкл AcrylCarrier і 20 мкл магнітних кульок до 500 мкл зв’язуючого буферного розчину, добре струсіть і потім приготуйте розчин кульок.Додайте 21 мл етанолу до змивів A і W, добре збовтайте, щоб отримати розчини змивів A і W відповідно.Потім 18 мкл суміші флуоресцентної ПЛР з нуклеїновою кислотою IFVA та 1 мкл ферменту RT-PCR додавали до 1 мкл розчину ТЕ, струшували та центрифугували протягом кількох секунд, отримуючи 20 мкл праймерів IAV та IBV.
Виконайте наступну процедуру очищення РНК: (1) Адсорбція РНК.Внесіть 526 мкл розчину осаду в центрифужну пробірку на 1,5 мл і додайте 150 мкл зразка, потім вручну струсіть пробірку вгору-вниз 10 разів.Перенесіть 676 мкл суміші в афінну колонку та центрифугуйте при 1,88 x 104 g протягом 60 секунд.Наступні дренажі потім викидаються.(2) Перший етап миття.Додайте 500 мкл промивного розчину А до афінної колонки, центрифугуйте при 1,88 x 104 g протягом 40 с і видаліть використаний розчин.Цей процес промивання повторювали двічі.(3) другий етап промивання.Додайте 500 мкл промивного розчину W до афінної колонки, центрифугуйте при 1,88 × 104 g протягом 15 с і видаліть використаний розчин.Цей процес промивання повторювали двічі.(4) Елюювання.Додайте 200 мкл елюату до афінної колонки та центрифугуйте при 1,88 x 104 g протягом 2 хв.(5) RT-PCR: елюат вводили в 20 мкл розчину праймера в пробірці для ПЛР, потім пробірку поміщали в апарат для ПЛР у реальному часі (SLAN-96P) для проведення процесу RT-PCR.Весь процес виявлення займає приблизно 140 хвилин (20 хвилин для очищення РНК і 120 хвилин для ПЛР-детекції).
526 мкл розчину кульок, 1000 мкл промивного розчину A, 1000 мкл промивного розчину W, 200 мкл елюату та 20 мкл розчину праймера попередньо додавали та зберігали в камерах M, W1, W2, E та камерах детекції ПЛР.Монтаж платформи.Потім 150 мкл зразка внесли піпеткою в камеру M, а платформу FAST-POCT вставили в тестовий інструмент, показаний на додатковому малюнку S9.Приблизно через 82 хвилини результати тесту були доступні.
Якщо не зазначено інше, усі результати тестування представлені як середнє значення ± стандартне відхилення після мінімум шести повторів із використанням лише платформи FAST-POCT і біологічно незалежних зразків.Жодні дані не були виключені з аналізу.Експерименти не випадкові.Під час експерименту дослідники не закривали очі на групові завдання.
Щоб отримати додаткові відомості про дизайн дослідження, перегляньте анотацію звіту про дослідження природи, посилання на яку наведено в цій статті.
Дані, що підтверджують результати цього дослідження, доступні в Додатковій інформації.У цій статті наведені вихідні дані.
Чагла, З. і Мадхукар, П. Бустери COVID-19 у багатих країнах затримають вакцини для всіх.Чагла, З. і Мадхукар, П. Бустери COVID-19 у багатих країнах затримають вакцини для всіх.Чагла, З. і Мадхукар, П. Бустери COVID-19 у багатих країнах затримають вакцини для всіх.Чагла, З. і Мадхукар, П. Повторна вакцинація проти COVID-19 у багатих країнах відкладе вакцинацію для всіх.Народна медицина.27, 1659–1665 (2021).
Фауст Л. та ін.Тестування на SARS-CoV-2 у країнах із низьким і середнім рівнем доходу: наявність і доступність у приватному секторі охорони здоров’я.мікробна інфекція.22, 511–514 (2020).
Всесвітня організація охорони здоров’я.Глобальна поширеність і захворюваність на окремі виліковні інфекції, що передаються статевим шляхом: огляд і оцінки.Женева: ВООЗ, WHO/HIV_AIDS/2 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66818/WHO_HIV_AIDS_2001.02.pdf (2001).
Fenton, EM та ін.Кілька 2D формованих тест-смужок бічного потоку.Додаток ASS.альма-матер.Інтер Мілан.1, 124–129 (2009).
Шиллінг К. М. та ін.Повністю закритий мікрофлюїдний аналізатор на паперовій основі.задній прохід.хімічний.84, 1579–1585 (2012).
Lapenter, N. та ін.Конкурентна паперова імунохроматографія в поєднанні з модифікованими ферментами електродами дозволяє здійснювати бездротовий моніторинг і електрохімічне визначення котиніну в сечі.Датчики 21, 1659 (2021).
Чжу, X. та ін.Кількісне визначення біомаркерів захворювань за допомогою універсальної латеральної рідинної платформи, інтегрованої з наноферментами, за допомогою глюкометра.біологічний датчик.Біоелектроніка.126, 690–696 (2019).
Бу, С. та ін.Тест-смужка на вагітність для виявлення патогенних бактерій за допомогою гібридних наноквітів конканаваліну А-хоріонічного гонадотропіну людини-Cu3(PO4)2, магнітної сепарації та зчитування зі смартфона.мікрокомп'ютер.Журнал.185, 464 (2018).